Javascript är för närvarande inaktiverat i din webbläsare. När javascript är inaktiverat kommer vissa funktioner på den här webbplatsen inte att fungera.
Registrera dina specifika uppgifter och specifika läkemedel av intresse, så matchar vi informationen du anger med artiklar i vår omfattande databas och skickar dig en PDF-kopia via e-post i god tid.
Kontrollera rörelsen hos magnetiska järnoxid-nanopartiklar för riktad tillförsel av cytostatika
Författare Toropova Y, Korolev D, Istomina M, Shulmeyster G, Petukhov A, Mishanin V, Gorshkov A, Podyacheva E, Gareev K, Bagrov A, Demidov O
Yana Toropova,1 Dmitry Korolev,1 Maria Istomina,1,2 Galina Shulmeyster,1 Alexey Petukhov,1,3 Vladimir Mishanin,1 Andrey Gorshkov,4 Ekaterina Podyacheva,1 Kamil Gareev,2 Alexei Bagrov,5 Oleg Demidov6,71Almazovs nationella medicinska forskningscenter vid Ryska federationens hälsoministerium, Sankt Petersburg, 197341, Ryska federationen; 2 Sankt Petersburgs elektrotekniska universitet “LETI”, Sankt Petersburg, 197376, Ryska federationen; 3 Centrum för personlig medicin, Almazovs statliga medicinska forskningscenter, Ryska federationens hälsoministerium, Sankt Petersburg, 197341, Ryssland; 4FSBI “Institutet för influensaforskning uppkallat efter A.A. Smorodintsev” Ryska federationens hälsoministerium, Sankt Petersburg, Ryska federationen; 5 Sechenov-institutet för evolutionär fysiologi och biokemi, Ryska vetenskapsakademin, Sankt Petersburg, Ryska federationen; 6 RAS Institutet för cytologi, St. Petersburg, 194064, Ryska federationen; 7INSERM U1231, Medicinska och farmaceutiska fakulteten, Bourgogne-Franche Comté, Dijons universitet, Frankrike Kommunikation: Yana Toropova Almazov Nationella medicinska forskningscentret, Ryska federationens hälsoministerium, Sankt Petersburg, 197341, Ryska federationen Tel +7 981 95264800 4997069 E-post [email protected] Bakgrund: En lovande metod för att hantera problemet med cytostatisk toxicitet är användningen av magnetiska nanopartiklar (MNP) för riktad läkemedelsleverans. Syfte: Att använda beräkningar för att bestämma de bästa egenskaperna hos det magnetfält som styr MNP in vivo, och att utvärdera effektiviteten av magnetronleverans av MNP till mustumörer in vitro och in vivo. (MNPs-ICG) används. In vivo-luminescensintensitetsstudier utfördes på tumörmöss, med och utan ett magnetfält vid det aktuella stället. Dessa studier utfördes på en hydrodynamisk byggnadsställning utvecklad av Institutet för experimentell medicin vid Almazov State Medical Research Center under det ryska hälsoministeriet. Resultat: Användningen av neodymmagneter främjade den selektiva ackumuleringen av MNP. En minut efter administrering av MNPs-ICG till tumörbärande möss ackumuleras MNPs-ICG huvudsakligen i levern. I frånvaro och närvaro av ett magnetfält indikerar detta dess metaboliska väg. Även om en ökning av fluorescensen i tumören observerades i närvaro av ett magnetfält, förändrades inte fluorescensintensiteten i djurets lever över tid. Slutsats: Denna typ av MNP, i kombination med den beräknade magnetfältstyrkan, kan ligga till grund för utveckling av magnetiskt kontrollerad administrering av cytostatika till tumörvävnader. Nyckelord: fluorescensanalys, indocyanin, järnoxidnanopartiklar, magnetronadministrering av cytostatika, tumörinriktning.
Tumörsjukdomar är en av de främsta dödsorsakerna världen över. Samtidigt kvarstår dynamiken med ökande sjuklighet och dödlighet i tumörsjukdomar.1 Den kemoterapi som används idag är fortfarande en av de viktigaste behandlingarna för olika tumörer. Samtidigt är utvecklingen av metoder för att minska cytostatikas systemiska toxicitet fortfarande relevant. En lovande metod för att lösa dess toxicitetsproblem är att använda nanoskaliga bärare för att rikta läkemedelsleveransmetoder, vilket kan ge lokal ackumulering av läkemedel i tumörvävnader utan att öka deras koncentration i friska organ och vävnader.2 Denna metod gör det möjligt att förbättra effektiviteten och målinriktningen av kemoterapeutiska läkemedel på tumörvävnader, samtidigt som deras systemiska toxicitet minskas.
Bland de olika nanopartiklar som övervägs för riktad administrering av cytostatika är magnetiska nanopartiklar (MNP) av särskilt intresse på grund av deras unika kemiska, biologiska och magnetiska egenskaper, vilket säkerställer deras mångsidighet. Därför kan magnetiska nanopartiklar användas som ett värmesystem för att behandla tumörer med hypertermi (magnetisk hypertermi). De kan också användas som diagnostiska medel (magnetisk resonansdiagnos). 3-5 Genom att använda dessa egenskaper, i kombination med möjligheten till MNP-ackumulering i ett specifikt område, genom användning av ett externt magnetfält, öppnar administreringen av riktade farmaceutiska preparat upp möjligheten att skapa ett multifunktionellt magnetronsystem för att rikta cytostatika mot tumörstället. Ett sådant system skulle inkludera MNP och magnetfält för att kontrollera deras rörelse i kroppen. I detta fall kan både externa magnetfält och magnetiska implantat placerade i det kroppsområde som innehåller tumören användas som källa till magnetfältet. 6 Den första metoden har allvarliga brister, inklusive behovet av att använda specialutrustning för magnetisk inriktning av läkemedel och behovet av att utbilda personal för att utföra kirurgi. Dessutom är denna metod begränsad av hög kostnad och är endast lämplig för "ytliga" tumörer nära kroppsytan. Den alternativa metoden att använda magnetiska implantat utökar tillämpningsområdet för denna teknik och underlättar dess användning på tumörer belägna i olika delar av kroppen. Både individuella magneter och magneter integrerade i den intraluminala stenten kan användas som implantat för tumörskador i ihåliga organ för att säkerställa deras öppenhet. Enligt vår egen opublicerade forskning är dessa dock inte tillräckligt magnetiska för att säkerställa retention av MNP från blodomloppet.
Effektiviteten av läkemedelsleverans via magnetron beror på många faktorer: egenskaperna hos själva den magnetiska bäraren och egenskaperna hos magnetfältskällan (inklusive de geometriska parametrarna för permanentmagneter och styrkan hos det magnetfält de genererar). Utvecklingen av framgångsrik teknik för leverans av magnetiskt styrda cellhämmare bör innefatta utveckling av lämpliga magnetiska nanoskaliga läkemedelsbärare, bedömning av deras säkerhet och utveckling av ett visualiseringsprotokoll som möjliggör spårning av deras rörelser i kroppen.
I denna studie beräknade vi matematiskt de optimala magnetfältsegenskaperna för att kontrollera den magnetiska nanoskaliga läkemedelsbäraren i kroppen. Möjligheten att hålla kvar MNP genom blodkärlsväggen under påverkan av ett applicerat magnetfält med dessa beräkningsegenskaper studerades också i isolerade råttblodkärl. Dessutom syntetiserade vi konjugat av MNP och fluorescerande ämnen och utvecklade ett protokoll för deras visualisering in vivo. Under in vivo-förhållanden, i tumörmodellmöss, studerades ackumuleringseffektiviteten av MNP i tumörvävnader vid systemisk administrering under påverkan av ett magnetfält.
I in vitro-studien använde vi referens-MNP, och i in vivo-studien använde vi MNP belagd med mjölksyrapolyester (polymjölksyra, PLA) innehållande ett fluorescerande ämne (indolecyanin; ICG). MNP-ICG ingår i. I detta fall, använd (MNP-PLA-EDA-ICG).
Syntesen och de fysikaliska och kemiska egenskaperna hos MNP har beskrivits i detalj på annat håll.7,8
För att syntetisera MNP-ICG framställdes först PLA-ICG-konjugat. En racemisk pulverblandning av PLA-D och PLA-L med en molekylvikt på 60 kDa användes.
Eftersom PLA och ICG båda är syror, måste man först syntetisera en aminoterminerad spacer på PLA för att syntetisera PLA-ICG-konjugat, vilket hjälper ICG att kemisorbera till spaceren. Spaceren syntetiserades med hjälp av etylendiamin (EDA), karbodiimidmetoden och vattenlöslig karbodiimid, 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDAC). PLA-EDA-spaceren syntetiseras enligt följande. Tillsätt ett 20-faldigt molärt överskott av EDA och ett 20-faldigt molärt överskott av EDAC till 2 ml 0,1 g/ml PLA-kloroformlösning. Syntesen utfördes i ett 15 ml polypropenprovrör på en skakmaskin med en hastighet av 300 min-1 i 2 timmar. Syntesschemat visas i figur 1. Upprepa syntesen med ett 200-faldigt överskott av reagens för att optimera syntesschemat.
Vid slutet av syntesen centrifugerades lösningen med en hastighet av 3000 min-1 i 5 minuter för att avlägsna överskott av utfällda polyetenderivat. Därefter tillsattes 2 ml av en 0,5 mg/ml ICG-lösning i dimetylsulfoxid (DMSO) till 2 ml-lösningen. Omröraren fixeras vid en omrörningshastighet av 300 min-1 i 2 timmar. Det schematiska diagrammet för det erhållna konjugatet visas i figur 2.
I 200 mg MNP tillsatte vi 4 ml PLA-EDA-ICG-konjugat. Använd en LS-220-skakapparat (LOIP, Ryssland) för att röra om suspensionen i 30 minuter med en frekvens av 300 min-1. Därefter tvättades den med isopropanol tre gånger och utsattes för magnetisk separation. Använd UZD-2 Ultrasonic Disperser (FSUE NII TVCH, Ryssland) för att tillsätta IPA till suspensionen i 5–10 minuter under kontinuerlig ultraljudsverkan. Efter den tredje IPA-tvätten tvättades fällningen med destillerat vatten och resuspenderades i fysiologisk saltlösning vid en koncentration av 2 mg/ml.
ZetaSizer Ultra-utrustningen (Malvern Instruments, Storbritannien) användes för att studera storleksfördelningen av den erhållna MNP:n i vattenlösningen. Ett transmissionselektronmikroskop (TEM) med en JEM-1400 STEM-fältemissionskatod (JEOL, Japan) användes för att studera formen och storleken på MNP:n.
I denna studie använder vi cylindriska permanentmagneter (kvalitet N35; med nickelskyddande beläggning) och följande standardstorlekar (långaxellängd × cylinderdiameter): 0,5×2 mm, 2×2 mm, 3×2 mm och 5×2 mm.
In vitro-studien av MNP-transport i modellsystemet utfördes på en hydrodynamisk byggnadsställning utvecklad av Institutet för experimentell medicin vid Almazov State Medical Research Center under det ryska hälsoministeriet. Volymen av den cirkulerande vätskan (destillerat vatten eller Krebs-Henseleit-lösning) är 225 ml. Axiellt magnetiserade cylindriska magneter används som permanentmagneter. Placera magneten på en hållare 1,5 mm från innerväggen i det centrala glasröret, med änden vänd mot rörets riktning (vertikal). Vätskeflödeshastigheten i den slutna slingan är 60 L/h (motsvarande en linjär hastighet på 0,225 m/s). Krebs-Henseleit-lösning används som en cirkulerande vätska eftersom den är en analog till plasma. Plasmans dynamiska viskositetskoefficient är 1,1–1,3 mPa∙s. 9 Mängden MNP som adsorberas i magnetfältet bestäms med spektrofotometri utifrån koncentrationen av järn i den cirkulerande vätskan efter experimentet.
Dessutom har experimentella studier utförts på en förbättrad strömningsmekaniktabell för att bestämma blodkärlens relativa permeabilitet. Huvudkomponenterna i det hydrodynamiska stödet visas i figur 3. Huvudkomponenterna i den hydrodynamiska stenten är en sluten slinga som simulerar tvärsnittet av modellens kärlsystem och en lagringstank. Modellvätskans rörelse längs blodkärlsmodulens kontur tillhandahålls av en peristaltisk pump. Under experimentet ska förångningen och det erforderliga temperaturintervallet bibehållas och systemparametrarna (temperatur, tryck, vätskeflödeshastighet och pH-värde) övervakas.
Figur 3 Blockschema över den uppställning som används för att studera permeabiliteten hos halspulsåderväggen. 1-lagringstank, 2-peristaltisk pump, 3-mekanism för att införa suspension innehållande MNP i slingan, 4-flödesmätare, 5-trycksensor i slingan, 6-värmeväxlare, 7-kammare med behållare, 8-källa för magnetfältet, 9-ballong med kolväten.
Kammaren som innehåller behållaren består av tre behållare: en yttre stor behållare och två små behållare, genom vilka armarna på den centrala kretsen passerar. Kanylen förs in i den lilla behållaren, behållaren är fäst på den lilla behållaren, och kanylens spets är tätt knuten med en tunn tråd. Utrymmet mellan den stora behållaren och den lilla behållaren fylls med destillerat vatten, och temperaturen förblir konstant tack vare anslutningen till värmeväxlaren. Utrymmet i den lilla behållaren fylls med Krebs-Henseleit-lösning för att bibehålla blodkärlscellernas livskraft. Tanken är också fylld med Krebs-Henseleit-lösning. Gasförsörjningssystemet (kol) används för att förånga lösningen i den lilla behållaren i lagringstanken och kammaren som innehåller behållaren (Figur 4).
Figur 4 Kammaren där behållaren är placerad. 1-Kanyl för att sänka ner blodkärlen, 2-Yttre kammare, 3-Liten kammare. Pilen indikerar modellvätskans riktning.
För att bestämma kärlväggens relativa permeabilitetsindex användes råttans halspulsåder.
Införandet av MNP-suspension (0,5 ml) i systemet har följande egenskaper: den totala inre volymen för tanken och anslutningsröret i slingan är 20 ml, och den inre volymen för varje kammare är 120 ml. Den externa magnetfältskällan är en permanentmagnet med en standardstorlek på 2 × 3 mm. Den installeras ovanför en av de små kamrarna, 1 cm från behållaren, med ena änden vänd mot behållarens vägg. Temperaturen hålls vid 37 °C. Rullpumpens effekt är inställd på 50 %, vilket motsvarar en hastighet på 17 cm/s. Som kontroll togs prover i en cell utan permanentmagneter.
En timme efter administrering av en given koncentration av MNP togs ett vätskeprov från kammaren. Partikelkoncentrationen mättes med en spektrofotometer med användning av Unico 2802S UV-Vis-spektrofotometer (United Products & Instruments, USA). Med hänsyn till absorptionsspektrumet för MNP-suspensionen utfördes mätningen vid 450 nm.
Enligt Rus-LASA-FELASA-riktlinjerna föds alla djur upp i specifika patogenfria anläggningar. Denna studie uppfyller alla relevanta etiska regler för djurförsök och forskning och har erhållit etiskt godkännande från Almazov National Medical Research Center (IACUC). Djuren drack vatten ad libitum och fick mat regelbundet.
Studien genomfördes på 10 sövda, 12 veckor gamla hanmöss av immundefekta NSG-typer (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj, Jackson Laboratory, USA)10, som vägde 22 g ± 10 %. Eftersom immuniteten hos immunbristmöss är undertryckt, möjliggör immunbristmöss i denna linje transplantation av mänskliga celler och vävnader utan avstötning. Kullsyskon från olika burar tilldelades slumpmässigt till experimentgruppen, och de samavlades eller exponerades systematiskt för strö från andra grupper för att säkerställa lika exponering för den gemensamma mikrobiotan.
HeLa-cellinjen för human cancer används för att etablera en xenograftmodell. Cellerna odlades i DMEM innehållande glutamin (PanEco, Ryssland), kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (Hyclone, USA), 100 CFU/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin. Cellinjen tillhandahölls vänligen av Gene Expression Regulation Laboratory vid Institutet för cellforskning vid den ryska vetenskapsakademin. Före injektion avlägsnades HeLa-celler från odlingsplasten med en 1:1 trypsin:Versene-lösning (Biolot, Ryssland). Efter tvättning suspenderades cellerna i komplett medium till en koncentration av 5×106 celler per 200 μl och späddes med basalmembranmatris (LDEV-FREE, MATRIGEL® CORNING®) (1:1, på is). Den beredda cellsuspensionen injicerades subkutant i huden på muslåren. Använd elektroniska skjutmått för att övervaka tumörtillväxten var tredje dag.
När tumören nådde 500 mm3 implanterades en permanentmagnet i försöksdjurets muskelvävnad nära tumören. I försöksgruppen (MNP-ICG + tumör-M) injicerades 0,1 ml MNP-suspension och exponerades för ett magnetfält. Obehandlade hela djur användes som kontroll (bakgrund). Dessutom användes djur som injicerats med 0,1 ml MNP men inte implanterats med magneter (MNP-ICG + tumör-BM).
Fluorescensvisualisering av in vivo- och in vitro-prover utfördes på IVIS Lumina LT serie III bioavbildningsapparat (PerkinElmer Inc., USA). För in vitro-visualisering tillsattes en volym av 1 ml syntetiskt PLA-EDA-ICG- och MNP-PLA-EDA-ICG-konjugat till plattbrunnarna. Med hänsyn till ICG-färgämnets fluorescensegenskaper valdes det bästa filtret som används för att bestämma provets ljusintensitet: den maximala excitationsvåglängden är 745 nm och emissionsvåglängden är 815 nm. Programvaran Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.) användes för att kvantitativt mäta fluorescensintensiteten hos brunnarna som innehöll konjugatet.
Fluorescensintensiteten och ackumuleringen av MNP-PLA-EDA-ICG-konjugatet mättes i in vivo-tumörmodellmöss, utan närvaro och applicering av ett magnetfält vid det aktuella stället. Mössen sövdes med isofluran, och sedan injicerades 0,1 ml MNP-PLA-EDA-ICG-konjugat genom svansvenen. Obehandlade möss användes som negativ kontroll för att erhålla en fluorescerande bakgrund. Efter intravenös administrering av konjugatet placerades djuret på en värmeplattform (37 °C) i kammaren i IVIS Lumina LT serie III fluorescensavbildare (PerkinElmer Inc.) medan inhalation med 2 % isofluranbedövning bibehölls. Använd ICG:s inbyggda filter (745–815 nm) för signaldetektering 1 minut och 15 minuter efter införandet av MNP.
För att bedöma ackumuleringen av konjugat i tumören täcktes djurets peritoneala område med papper, vilket gjorde det möjligt att eliminera den starka fluorescensen som är förknippad med ackumuleringen av partiklar i levern. Efter att ha studerat biodistributionen av MNP-PLA-EDA-ICG avlivades djuren humant genom en överdos av isoflurananestesi för efterföljande separering av tumörområdena och kvantitativ bedömning av fluorescensstrålning. Använd programvaran Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.) för att manuellt bearbeta signalanalysen från det valda intresseområdet. Tre mätningar gjordes för varje djur (n = 9).
I denna studie kvantifierade vi inte den framgångsrika laddningen av ICG på MNP-ICG. Dessutom jämförde vi inte retentionseffektiviteten hos nanopartiklar under påverkan av permanentmagneter av olika former. Dessutom utvärderade vi inte magnetfältets långsiktiga effekt på retentionen av nanopartiklar i tumörvävnader.
Nanopartiklar dominerar, med en genomsnittlig storlek på 195,4 nm. Dessutom innehöll suspensionen agglomerat med en genomsnittlig storlek på 1176,0 nm (Figur 5A). Därefter filtrerades delen genom ett centrifugalfilter. Partiklarnas zetapotential är -15,69 mV (Figur 5B).
Figur 5 Suspensionens fysikaliska egenskaper: (A) partikelstorleksfördelning; (B) partikelfördelning vid zetapotential; (C) TEM-fotografi av nanopartiklar.
Partikelstorleken är i princip 200 nm (Figur 5C), bestående av en enda MNP med en storlek på 20 nm, och ett PLA-EDA-ICG-konjugerat organiskt skal med en lägre elektrondensitet. Bildningen av agglomerat i vattenlösningar kan förklaras av den relativt låga modulen för den elektromotoriska kraften hos enskilda nanopartiklar.
För permanentmagneter, när magnetiseringen är koncentrerad i volymen V, delas integraluttrycket in i två integraler, nämligen volymen och ytan:
I fallet med ett prov med konstant magnetisering är strömtätheten noll. Då kommer uttrycket för den magnetiska induktionsvektorn att anta följande form:
Använd MATLAB-programmet (MathWorks, Inc., USA) för numeriska beräkningar, ETU "LETI" akademisk licensnummer 40502181.
Som visas i figur 7, figur 8 och figur 9, genereras det starkaste magnetfältet av en magnet som är orienterad axiellt från cylinderns ände. Den effektiva verkningsradien motsvarar magnetens geometri. I cylindriska magneter med en cylinder vars längd är större än dess diameter observeras det starkaste magnetfältet i axial-radiell riktning (för motsvarande komponent); därför är ett par cylindrar med ett större bildförhållande (diameter och längd) för MNP-adsorption mest effektiv.
Fig. 7 Komponenten av den magnetiska induktionsintensiteten Bz längs magnetens Oz-axel; magnetens standardstorlek: svart linje 0,5×2 mm, blå linje 2×2 mm, grön linje 3×2 mm, röd linje 5×2 mm.
Figur 8 Den magnetiska induktionskomponenten Br är vinkelrät mot magnetaxeln Oz; magnetens standardstorlek: svart linje 0,5×2 mm, blå linje 2×2 mm, grön linje 3×2 mm, röd linje 5×2 mm.
Figur 9 Den magnetiska induktionsintensiteten Bz-komponenten på avståndet r från magnetens ändaxel (z=0); magnetens standardstorlek: svart linje 0,5×2 mm, blå linje 2×2 mm, grön linje 3×2 mm, röd linje 5×2 mm.
Figur 10 Magnetisk induktionskomponent längs radiell riktning; standardmagnetstorlek: svart linje 0,5×2 mm, blå linje 2×2 mm, grön linje 3×2 mm, röd linje 5×2 mm.
Speciella hydrodynamiska modeller kan användas för att studera metoden för MNP-leverans till tumörvävnader, koncentrera nanopartiklar i målområdet och bestämma nanopartiklarnas beteende under hydrodynamiska förhållanden i cirkulationssystemet. Permanentmagneter kan användas som externa magnetfält. Om vi ​​ignorerar den magnetostatiska interaktionen mellan nanopartiklarna och inte beaktar den magnetiska vätskemodellen, är det tillräckligt att uppskatta interaktionen mellan magneten och en enskild nanopartikel med en dipol-dipol-approximation.
Där m är magnetens magnetiska moment, r är radievektorn för den punkt där nanopartikeln är belägen och k är systemfaktorn. I dipolapproximationen har magnetens fält en liknande konfiguration (Figur 11).
I ett likformigt magnetfält roterar nanopartiklarna endast längs kraftlinjerna. I ett icke-likformigt magnetfält verkar kraften på dem:
Där är derivatan av en given riktning l. Dessutom drar kraften nanopartiklarna in i de mest ojämna områdena i fältet, det vill säga att krökningen och densiteten hos kraftlinjerna ökar.
Därför är det önskvärt att använda en tillräckligt stark magnet (eller magnetkedja) med tydlig axiell anisotropi i det område där partiklarna finns.
Tabell 1 visar förmågan hos en enda magnet som en tillräcklig magnetfältskälla för att fånga och bibehålla MNP i kärlbädden i applikationsfältet.